金相顯微鏡--顯微分光光度計(jì)

顯微分光光度計(jì)是—‘種在不同波長(zhǎng)下測(cè)定顯微鏡標(biāo)本成分光吸收的儀器、實(shí)質(zhì)上它是長(zhǎng)期用于分析化學(xué)中的分光光度計(jì)與顯微鏡的結(jié)合。它可以用來(lái)測(cè)定細(xì)胞或細(xì)胞器內(nèi)一些重要的大分子物質(zhì)（如DNA、RNA、蛋白質(zhì)等）的含量，因此在繃qb化學(xué)和組織化學(xué)的定量研究中是一種*的工具。

金相顯微鏡--顯微分光光度計(jì)主要由光源、干涉濾片（或單色儀）、顯微饒、測(cè)量裝置和顯示控制系統(tǒng)等兒部分所組成＜圖16．4）。這種儀器具有雙重光源系統(tǒng)，一個(gè)觀察光源使用低壓白熾燈，用于觀察和聚焦顯微鏡標(biāo)本；另一個(gè)是光度計(jì)光源，使用高壓氣體放電燈．用于標(biāo)本的光度測(cè)量。光源連接有高度精密的穩(wěn)壓供電系統(tǒng)，一般輸出電壓的變化控制在o．033％以內(nèi)。用于分光光度術(shù)的顯微鏡是高性能的專門研究顯微鏡，它可以組裝雙重光源和測(cè)旦裝置，并且在光度計(jì)筒內(nèi)具有一個(gè)特殊的測(cè)量光闌，光闌的直徑可以改變，直到可以測(cè)量直徑為1μm大小的測(cè)量區(qū)域，測(cè)量光闌可以根據(jù)被測(cè)物體的形狀選用圓形、八角形、方形或矩形的。

金相顯微鏡--顯微分光光度計(jì)由于生物標(biāo)本中被測(cè)定的不問(wèn)物質(zhì)在光譜吸收曲線上有特異的吸收高峰，因此在測(cè)定某一物質(zhì)時(shí)，必須使用能夠產(chǎn)生很窄光譜區(qū)域光的于涉濾片。這種干涉蹈片分為兩種，一種是窄通帶干涉濾片，帶寬為o．5一15nm，另一種是宛通帶干涉濾片，帶寬為15—18nm。能夠產(chǎn)嫂單色光的比較理想的另一種裝置是單色儀（圖16．；中的3），它誣道光柵（或棱鏡）散射來(lái)自具有連續(xù)發(fā)射光譜的強(qiáng)光源的光，然后在一定的光譜范圍（200一1，ooonm）內(nèi)可以任意選擇具有很窄帶寬的單色光，在單色僅中波長(zhǎng)范圍的調(diào)節(jié)*是自動(dòng)的，因此通過(guò)標(biāo)本光的波長(zhǎng)可以迅速靈活地改變，使用非常方便。在使用單色儀時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)，使單色儀出縫的像成在孔徑光鬧的平面上，并且讓孔徑光闌正好充滿單色儀的出縫。出縫的寬度可以選擇，但從圖16．6沖單色儀波長(zhǎng)選擇刻度盤上可以看出，出縫放寬，單色光的帶寬愈大。當(dāng)出縫寬度為o．5mm時(shí)，帶覽為3．3nm，當(dāng)比縫為3mm時(shí)，帶竟則為19。8nm。

圖16．6可以說(shuō)明顯微分光光度計(jì)的使用原理，兩條光譜吸收曲線I和Ⅱ是在顯微分光光度計(jì)上，用通過(guò)火蛇紅血細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的直徑為lvm的光點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量而記錄的。在這種紉胞的細(xì)胞質(zhì)中血紅蛋白的出現(xiàn)引起丁近545nm處的*個(gè)吸收高峰，而更高的第二個(gè)局峰出現(xiàn)在416nm處；在紫外光區(qū)域出現(xiàn)吸收的*次下降，在300一320nm處又回升出現(xiàn)3個(gè)高波。在細(xì)胞核的吸收曲線（Ⅱ）中，在416nm處也觀察到•—個(gè)吸收高煉，但這并不是細(xì)胞核本身的吸收，而是由于分市在光束所要通過(guò)的細(xì)胞核．上面和下面的細(xì)胞質(zhì)中大量的血紅蛋白所引起的；在較短波長(zhǎng)曲紫外光范圍內(nèi)，在260nm范圍可以觀察到非常明顯的zui大吸收值，這個(gè)范圍的吸收除了蛋白質(zhì)的吸收以外，zui主要的足由細(xì)胞核中高濃度的核酸在260nm處的特異吸收所引起的。

金相顯微鏡--由于在顯微分光光度計(jì)中，通過(guò)標(biāo)本的光束在大多數(shù)情況下直徑只有一至幾個(gè)Mm，因此要記錄這樣一個(gè)小光點(diǎn)的非常微弱的信號(hào)就需要非常強(qiáng)的放大裝置，現(xiàn)在一般使用光電倍增管。光電倍增管可以把微弱的光信號(hào)變?yōu)殡娏?，并且能夠放?0‘一10’倍，因此它的靈敏度是非常高的。測(cè)量的結(jié)果可以通過(guò)顯示系統(tǒng)以數(shù)字顯示出來(lái)，或者通過(guò)電傳打字記錄下來(lái)。

作為分光光度計(jì)的基本原理也適用于顯微分光光度計(jì)，當(dāng)光線迎過(guò)物質(zhì)標(biāo)本的單色溶液時(shí)，除了少量的反射和散射而外，一部分光被吸收過(guò)。透射光密度（11）與入射光密度（1o）的比值被稱為透射串（T），—種具有光吸收而剩余的光透在一定的條件下，例如當(dāng)溶液為單色并且不存在濃度放應(yīng)時(shí)，透射率倒數(shù)的以10為底的對(duì)數(shù)與生色物質(zhì)的濃度成比例關(guān)系，這個(gè)數(shù)值被稱為消光值（E）。

金相顯微鏡--在顯微分光光度計(jì)上所進(jìn)行的生物標(biāo)本中光吸收物質(zhì)的測(cè)定就遠(yuǎn)還沒(méi)有如此簡(jiǎn)單，即就是當(dāng)染料（或天然色素）具有己知的吸收光譜并且服從于郎伯一比爾定律時(shí)也是非常復(fù)雜的。在這種生物標(biāo)本中不僅光學(xué)密度是*異質(zhì)的，而義它的形狀是不規(guī)則的，光程長(zhǎng)也是不清楚的。只有當(dāng)被測(cè)物體的形狀是規(guī)則的幾何形狀時(shí)才接近于比色槽的情況，這種情況出現(xiàn)在具有球體形狀的細(xì)胞核中。在理論上，一個(gè)用字爾根法染色的細(xì)胞核可以看作是未染色的細(xì)胞質(zhì)中在球形比色槽內(nèi)的堿性品紅染料的溶胚。

對(duì)于生物學(xué)標(biāo)本的顯微分光光度測(cè)量會(huì)受到一種分初誤差的影響，這種誤差是由于生物物質(zhì)的不均勻分布所造成的，在有些情況下這種誤差可能是相當(dāng)大的。因此在顯微分光光度術(shù)中，一般可以來(lái)用掃描法、雙波法、——波雙區(qū)法等幾種方法克服生色物質(zhì)分布的不均勻性效果，從而可以在一定程度上解決分稍誤差的問(wèn)題。在使用自動(dòng)掃描儀器時(shí)，物體可以被分割為很小的區(qū)域，因此可以把每個(gè)小區(qū)域當(dāng)作是均質(zhì)的，這樣采用綜合一系列的消光值讀數(shù)，對(duì)于整個(gè)生色物質(zhì)來(lái)說(shuō)就可以得到一個(gè)總的消光值。

金相顯微鏡--顯微分光光度計(jì)使用一種新型的像掃描或標(biāo)本掃描儀器和積分顯微光度計(jì)，并且盡量避免不同來(lái)源的誤差時(shí)，就可以以一定的重復(fù)性直接測(cè)定游離的紅血細(xì)胞中30pg（30×10-12克）的血紅蛋白的員；并且可以通過(guò)特殊的罕爾根染色反應(yīng)以同樣的準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定細(xì)胞核中的DNA，也可以通過(guò)對(duì)于蛋白質(zhì)干擾的矯正在天然吸收的基礎(chǔ)上對(duì)核酸進(jìn)行測(cè)定。

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