徠卡顯微鏡的電子光學系統(tǒng)

 

徠卡生物顯微鏡相當于掃描電子顯微鏡的電子光學系統(tǒng)‘所不同之處是：L出射的電子束束流強度要大，而且要穩(wěn)定。電子束直徑一般為iP、不能因縮小電子轟擊區(qū)而過分縮小電子束直徑，因為束流強度與京的半徑8／3次方成正比。2．發(fā)射電子之間能量的離散要小。因此往往采用熱電子發(fā)射的三極電子槍。3物鏡的中心不能太小。因為X射線以大角度射出，為了提高譜儀效率也必須大角度收集。因此物鏡線圈所占空間要大為縮小。辦法之一是用小線圈透鏡，通強電流。但電流強產(chǎn)熱多，就必須用冷阱冷卻物鏡。

 

徠卡生物顯微鏡生物醫(yī)學標本常用冰凍超薄切片。由于x射線收集時間長達幾十秒甚至100秒。束流強度很大的電子束在這樣長的時間內(nèi)轟擊標本會把標本燒毀，因此必須注入液氮，使標本溫度在一800c以下。諾儀可對待征x射線進行波長及能量分析。進行波長分析時的被語儀主要是合適的分光晶體，在一定角度使x射線產(chǎn)生衍射。目前多用的是對特征x射線進行能量分析的能譜儀。電鏡室常用的是51（u）x射線能諾儀。它的探測器是si（H）二極管理漂移硅型）。這種半導體探測器可以看作一種“固體電離室”。當x射線進入探測器后，在半導體的靈敏區(qū)內(nèi)損耗能量產(chǎn)生電子一空穴時，將它們收集后可形成電脈沖記錄下來*由于si（Li）半導體的靈敏區(qū)大，所以探測效率高。又由于產(chǎn)生一個電子一空穴時所需的平均能量很低，所以這種探測器靈敏度和統(tǒng)計特性都比較好。s1（Li）能譜儀的分析速度快，可以同時分析和確定樣品中含有的原子序數(shù)z＞11的所有元素。雖然該類能諾儀的缺點是能量分析率低，約150ev（波譜儀約5ev），但由于快速分析及效率高等突出優(yōu)點，目前已成為掃描電鏡和透射電鏡上的主要附件。能譜儀都與計算機連用。熒光屏上不但顯示特征x射線譜，而且計算機技能量分布依次給出元素名稱及濃度。

 

徠卡顯微鏡的標本制備方法

 

徠卡生物顯微鏡70年代在探針技術(shù)上有兩大進展，*是將透射電鏡與x微區(qū)分析結(jié)合*第二是固態(tài)能量色散x一線探測器的應用。這便使得操作人員可將一細電子束準確地置于某細胞器內(nèi)，使探針電流控制在幾個nA范圍內(nèi)，減少了對標本的損傷，提高了像的質(zhì)量。為此，對標本的制備提出了更高的要求。幾個實驗室不約而同地在探索如何在保存超微結(jié)構(gòu)的同時也保存元素成分在原位而不移動或丟失。HaH實驗室的工作人員研究肌細胞線粒體對鋇的攝取，他們發(fā)現(xiàn)用醋酸鈾染色后線粒體中只有鈾而無鋇，只有在不經(jīng)染色的標本中線粒體內(nèi)才有鋇。他們在研究雞胚紅細胞核中的鈉和其它電解質(zhì)時，發(fā)現(xiàn)胞核內(nèi)鈉濃度幾乎與胞外介質(zhì)無差別。但他們對標本進行冰凍切片和冰凍干燥處理后，發(fā)現(xiàn)上述結(jié)果是錯誤的。因此Hall等認為標本制備的*方法是將組織立即冰凍（即粹冷固定）．然后用徠卡冰凍切片機做冰陳超薄切片?；?qū)Ρ鶅龀∏衅苯佑^察分析，或?qū)⑵浔鶅龈稍锖笤儆^察。他特別提出在分析組織的細胞外空間成分時，用未經(jīng)干燥的冰凍超薄切片直接分析。

 

徠卡生物顯微鏡由于組織未經(jīng)四氧化鑰固定和染色，在經(jīng)過冰涼固定后結(jié)構(gòu)雖得以保存．但反差相當差。人們又想到是否可用低溫置換固定或組織經(jīng)冰凍干燥后再包埋、切片及染色以提高反差，增進像的質(zhì)量。R加s實驗室在此方面做了較深入的工作。他們以大鼠胰腺外分泌細胞不同部位的電解質(zhì)分布為觀測對象，比較幾種標本處理方法的優(yōu)劣。首先對大鼠做主動脈灌注，然后對胰腺作原位冰凍固定．或移出后做冰凍固定。他們對冰凍固定后的胰腺用自制的裝置做以下幾種處理；1．作多聚甲醛和四氧化俄低溫置換固定及樹脂包埋（Fs）；2．低溫干燥后進行樹脂包埋（四）和L冰凍超薄切片后進行冰涼干燥（cs）。然后分別對細胞的頂部胞漿、基部腦漿、酶元顆粒及錢糧體中的Ha、M8、P、s、酗、K及Ca做定量測定（刪1／k8drywt）。其結(jié)果如表lo一1所示。由表可見，幾種方法的結(jié)果十分不同。低溫置換固定后包埋使電解質(zhì)丟失zui多。即使低溫干燥后做樹脂包埋也有明顯丟失，特別在頂部及基部胞漿中磷和鉀丟失zui多。RoM等認為是由于使用了高度疏水的sPun和Epn樹脂包埋時，使磷脂提取，質(zhì)膜損傷后胞內(nèi)可移動的鉀及其它成分漏出所致。因此，RM的結(jié)論是對于研究元素在細胞內(nèi)不同部位及細胞器中的分布而言，組織冰凍固定、冰凍超薄切片及隨后的冰凍干燥是的方法。

 

備注:徠卡顯微鏡儀器結(jié)構(gòu)特點部分文章由北京中儀光科科技發(fā)展有限公司編輯上傳。