奧林巴斯生物顯微鏡標(biāo)本制備方法
奧林巴斯生物顯微鏡分散細(xì)胞是指非實(shí)體組織的細(xì)胞，它們單個(gè)分散的存在，如血細(xì)胞，胸、腹水中的細(xì)胞等。培養(yǎng)細(xì)胞雖不是分散細(xì)胞，但標(biāo)本制各原則與分散細(xì)胞相似。奧林巴斯生物顯微鏡分散細(xì)胞懸浮于體液中，要使它們聚集，必須經(jīng)過離心，但離心力會(huì)損傷細(xì)胞，特別是破壞細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)。如血小板在血中為盤狀，表面光滑，高速離心后，血小板變囚，表面出現(xiàn)許多突起，成為棘球狀。血小板內(nèi)部也有明顯改變，即血小板外形不規(guī)則，細(xì)胞器及顆粒聚集在血小板中心，被一束微管緊緊圍住，傲管與質(zhì)膜之間有較寬裕的腦漿。這是血小板被澈話的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。離心可使靜止血小板激活。時(shí)間過長，速度過高的離心還會(huì)使血小板質(zhì)膜破裂，細(xì)胞器溢出。因此，在制備分散細(xì)胞標(biāo)本時(shí)，在離心前固定。此外，由于分散細(xì)胞懸浮于體液中，將細(xì)胞固定后的蛋白質(zhì)一同固定，而且這些固定后的蛋白小凝塊附著在細(xì)胞表面，遮蓋細(xì)胞表面細(xì)微結(jié)構(gòu)，妨礙觀察。因此必須沖洗充分。此外，必須使分散細(xì)胞附著在一個(gè)表面上進(jìn)行脫水、干燥等操作。這幾個(gè)問題是制理分散細(xì)胞掃描電鏡標(biāo)本的特殊問題。下面對奧林巴斯生物顯微鏡分散紉胞掃描電鏡標(biāo)本制備方法詳細(xì)分步敘述：
1．奧林巴斯生物顯微鏡固定：只用戊二醛固定便能收到很好的效果，但要兩次固定，在*次固定前需使細(xì)胞在類似體液的條件下，保持體內(nèi)的形狀。由于血細(xì)胞、旗水細(xì)胞等在取出時(shí)經(jīng)過穿刺針的紉孔而變形，必須設(shè)法使細(xì)胞于固定前恢復(fù)為原來形狀，才能在電鏡下看到真實(shí)的細(xì)胞形態(tài)。現(xiàn)以紅細(xì)胞及血小板為例，詳細(xì)說明如下：
（1）奧林巴斯生物顯微鏡紅細(xì)胞：
將1滴血（一般取靜脈血為好，手指或耳垂取血時(shí)由于擠壓往往使細(xì)胞嚴(yán)重變形而損傷細(xì)胞）放到（5—6）m1磷酸鹽緩沖液中。緩沖液pH為7．2—7．4，370C，滲透壓為Ho毫滲（即與正常人血漿滲透壓相等）。
（2）
奧林巴斯生物顯微鏡血小板：取靜脈血10m1，放入塑料或硅化的玻璃試管中。用構(gòu)撤酸鈉或肝家抗凝，離心[（900一1100）轉(zhuǎn)／分，10分鐘]，用塑料吸管或硅化的玻璃吸管將富血小扳血漿（PRP）吸出并轉(zhuǎn)移至另一塑料試管或硅化的玻璃試管中，PRP約3—4創(chuàng)，376c溫育15分鐘，目的是使血小板恢復(fù)為正常的形態(tài)。加入戊二醛（硝釀鹽或二甲肺酸鈉緩沖液，PH7．2—7．4），使?jié)舛葹閛．25％。在37。c下繼續(xù)溫育15分鐘，以完成*次固定。胸、腹水細(xì)胞以及其它體液中的細(xì)胞標(biāo)本制備方法與以上列舉的兩例類似，培養(yǎng)細(xì)胞的標(biāo)本制備原則也應(yīng)該是先預(yù)固定后再離心集中。具體做法是在培養(yǎng)液加入戊二醛，同樣，濃度為o．25％，15分鐘后，用橡皮鏟將細(xì)胞取出，離心。低濃度戊二醛使細(xì)胞初步固定，再經(jīng)離心集中便不會(huì)使細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，但離心力仍不能過大，時(shí)間也不能過長。如紅紉胞為（900一1100）轉(zhuǎn)／分，8分鐘；血小板為xoo轉(zhuǎn)／分，lo分鐘。離心后棄上清，在細(xì)胞沉淀中加入2％戊二醛，用吸管反復(fù)歡打，使細(xì)胞分散。于室溫下再固定30分鐘。如果對同一種細(xì)胞在觀察其表面結(jié)構(gòu)的同時(shí)還要觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)，即需分出一半制做超薄切片標(biāo)本．則*次固定所用的戊二醛濃度可稍大些，可用o．5％G將細(xì)胞離心集中后，取出一半直接用心四氧化餓固定即可。
2．奧林巴斯生物顯微鏡清洗：清洗的目的是除洗去固定液外，還要將細(xì)胞分散，即將細(xì)胞分成一個(gè)個(gè)散在的細(xì)胞。還要把經(jīng)戊二醛固定后體液中的小蛋白質(zhì)凝塊洗去，并使這些蛋白質(zhì)凝塊脫離細(xì)胞表面，以免遮蓋細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)。因此，清洗這一步驟十分重要，需注意以下幾點(diǎn)：
（1）清洗所用的水必須十分清潔，預(yù)先經(jīng)微孔濾膜過濾以除去水中的細(xì)菌及顆粒雜質(zhì)。
（2）清洗時(shí)需用力吹打，多次昧打，每次清洗用液量在8mI以上。需清洗三次。
（3）清洗用液是雙藥水，而不用緩沖液。因緩沖液中的鹽可能在脫水時(shí)析出并粘在細(xì)胞表面，使標(biāo)本污染。
（4）每次吹打后需將已用過的滴管洗凈，用過濾的雙蒸水沖凈后第二溫清洗時(shí)再用*不然會(huì)有些細(xì)胞鉆附滴管壁上，放置室溫下便自然干燥。這些自然干燥后的細(xì)胞若進(jìn)到標(biāo)本中則影響標(biāo)本質(zhì)量。
（5）每次清洗后需離心，離心時(shí)間不能過長，離心力不可太大。因?yàn)殡x心的目的是使細(xì)胞沉降，而小蛋白凝塊仍懸浮于上清液中，與清洗液一同棄去。
3．奧林巴斯生物顯微鏡脫水與樣品附著：由于多次離心使細(xì)胞丟失，因此先將細(xì)胞附著在玻片或塑料片表面，使細(xì)胞隨同該進(jìn)片或塑料片一起脫水、干燥。為使細(xì)胞能附著在玻片或塑料片，需先在玻片或塑料片上鋪設(shè)一層膜。鋪膜方法如下：
（1）zui簡單的方法是鋪一層薄的聚乙烯醇縮甲醛（for帥）膜。將洗凈的玻片在（o．5—1）％聚乙烯醇紹甲醛氯仿溶液中浸蘸，待氯仿?lián)]發(fā)后玻片上呈現(xiàn)一層白膜，將玻片在氯仿中振蕩幾次使膜變薄即可用。
（2）將o．1％多聚L一賴氨酸（制備時(shí)將1mg多聚賴氨酸溶于lml過濾后的水中）墑在洗凈的玻片上，待液滴展開后在45。c烘箱中干燥。此種方法，因?yàn)槎嗑踠—賴氨酸帶正電荷，能使較多的表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞附著。
（3）將血漿和甘油各以（30一40）％，和（3—5）％的比例加到蒸餾水中，成為甘油蛋白濃。將該液滴在洗凈的玻片上，展開并烘干。將鋪好的蛋白膜浸入2％戊二醛中使蛋白固定，洗凈后干燥可備用。使用前將血漿滴在該蛋白膜上使之“活化”．30分鐘后用緩沖液沖淡，便可直接應(yīng)用。
奧林巴斯生物顯微鏡將固定與清洗后的細(xì)胞用過濾后的水制成濃度適宜的細(xì)胞懸濃，懸滴在已鋪好膜的玻片或塑料片上，在濕潤、低溫（40c）環(huán)境中放置（30一120）分鐘，使細(xì)胞附著到膜上。用細(xì)鑷子夾起玻片在清潔的雙蒸水中振蕩，洗去末附著的細(xì)胞。然后迅速故人盛有50％丙損（或乙醇）的器皿中。脫水過程是將玻片每隔約3分鐘，依次故入濃度遞增的丙酮或乙醇中，或在放玻片的器皿中不斷增加脫水劑濃度。據(jù)作者所在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，后一種操作比較方便。具體做法可每隔3分鐘將器皿中的脫水劑吸出一半，再加入濃度為loo％的等量脫水劑。經(jīng)過5—6次操作，器皿令脫水劑濃度達(dá)99．5％以上。細(xì)胞脫水成功。臨界點(diǎn)干燥后將玻片或塑料片用導(dǎo)電膠粘于樣品墩上進(jìn)行金屈鍍膜。
奧林巴斯生物顯微鏡利用第三種方法鋪設(shè)的膜附著細(xì)胞也有方便之處?？蓪⒔?jīng)低濃度戊二醛固定后的細(xì)胞懸滿在“活化”后的蛋白膜上，放置10分鐘，將玻片或塑料片浸于2％戊二醛中，30分鐘后用過濾雙蒸水沖清，再按上述方法脫水、干燥及金屬鍍膜。
